摘要：采用維生素B6(VB6)修飾玻碳電極生物傳感器，對生物樣品中的鋁形態用示差脈沖伏安法進行了測定。VB6的氧化峰電流隨著加入鋁濃度的增加而下降，而峰電位不變。本文形態分析的方法是建立在兩個pH條件下VB6對鋁的配位能力不同的基礎上的。對其應用于鋁形態區分的機理從文獻和模擬計算進行了探討。這種靈敏、簡單的形態分析方法成功地應用于對人血清，腦脊液等體液中鋁形態分析，并與超濾、滲析等方法進行比較，結果一致。與其它形態分析技術相比，本法具有高靈敏度、儀器便宜、操作簡單和測定快速等優點。
關鍵詞：鋁；兒茶酚類；形態分析；示差脈沖伏安法；人體液
中圖分類號：O657.1 文獻標識碼：A

一、前言

微量元素在生物體中的作用，尤其是對人體健康的影響是當前生物學、醫學和化學科研工作者研究的熱門交叉課題[1~7]。鋁被公認對人體具有毒性，其致毒機理雖然還不清楚，但是大量的證據表明鋁與某些疾病相關聯，比如阿爾滋海默氏癥、帕金森氏癥、糖尿病、癌癥等[3,6]。然而鋁的生物有效性和毒性依賴于它在溶液中的形態分布[3,4,8]。在各種鋁存在形態中，正電荷的水合鋁離子（[Al(H2O)6]3+），羥基鋁（[Al(OH)(H2O)5]2+，[Al(OH)2(H2O)4]+等）被認為最具毒性，而有機結合態的鋁一般被認為是無毒的形態[7-15]。人體中吸收的鋁是通過血液傳輸的。血清是一個十分復雜的混合物，它的組成包括脂類(脂蛋白)、蛋白質（例如免疫球蛋白、白蛋白和鐵轉移蛋白）、小分子，還有一些離子等等[11]。已經有文獻報道鋁在血清中的主要形態是Al-去鐵胺和Al－鐵蛋白[8,9]。其它諸如白蛋白的可能結合鋁的大分子量(HMM)的蛋白質，被認為是非常弱的金屬離子配位體，不足以競爭結合一定數量的鋁[16,17]。對于小分子量(LMM)的配體來說，檸檬酸和磷酸是最重要的。氨基酸、乳酸、草酸，及其它無機陰離子都競爭不過檸檬酸與磷酸[16]。

因此，研究鋁在人體中的結合形態、對其生理作用，對人類健康的影響和采取有效的預防措施來保護人類健康及開發相應的治療藥物具有重要意義。

鋁離子形態分析方法可以被分為四類[18]：（1）基于化學模型的熱力學平衡計算。（2）基于分析試劑與各種鋁形態的反應動力學的差異進行分離分析。（3）直接光譜測定技術，如核磁共振（NMR）。最廣泛應用的是27Al-NMR。（4）聯用技術，先是進行有效的分離（超濾、滲析），接著光譜測定。近十年來，此法在生物體液鋁形態分析中占據了重要地位。但是，譜學技術的儀器昂貴，形態分析操作過程繁雜，易引入污染物，核磁共振的靈敏度較低，不能應用于實際樣品的分析中，而超濾、滲析則因操作問題會帶來較大誤差。近年來，電化學方法由于靈敏度高、操作方便和儀器便宜等優點被廣泛應用于鋁的形態分析[3,4]。我們實驗室采用一系列試劑用于電化學Al形態區分，并與經典的Driscoll方法比較，獲得了滿意的結果[8-14]。研究中我們發現，在酸性條件下，選擇適當試劑可以在pH4~5酸性區間測定無機單核鋁，此時絕大部分無機單核鋁組分均被分析試劑奪取，但是，有機結合鋁形態仍然很穩定，能夠抵抗來自分析試劑的競爭配位。而在pH8~9堿性條件下，分析試劑具有足夠強的配位能力，不僅能從無機單核鋁，而且可以從幾乎所有有機結合態鋁中把鋁奪取出來，從而測定總單核鋁。再用ICP測定總鋁，減去單核鋁濃度可以獲得聚合多核鋁濃度，由此進行天然水體和體液中鋁形態區分[13,14]。

我們選擇了維生素B6(VB6)來測定鋁，它們的化學結構見圖1。VB6其化學成分為鹽酸吡哆醇，是一種常見的營養藥。VB6在體內參與氨基酸代謝、促進氨基酸的吸收和蛋白質的合成、參與血紅素的合成等。VB6在臨床上也有許多用途。通過實驗發現鋁與VB6會發生配位，這樣抑制了它們的氧化。這就是VB6電化學方法測定鋁的理論基礎，由此建立了VB6示差脈沖伏安法，對生物樣品中的鋁形態分析進行了分析，并與超濾、滲析等方法進行了比較，結果令人滿意。與其它形態分析技術相比，電化學具有高靈敏度、儀器便宜、操作簡單和測定快速等優點。

二、實驗部分

1、儀器

三電極系統：玻碳電極為工作電極，鉑片為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。分析測定在美國BAS公司的BAS-100電分析儀上進行。示差脈沖伏安參數為：掃速20mV/s，脈沖幅度50mV，脈沖寬度60ms。79-1型磁力加熱攪拌器（國華儀器廠）。PXD-12型數字式離子計（江蘇電分析儀器廠）。超濾裝置是Amicon公司的Stirred Ultrafiltration Cells (Model 8200)，超濾膜的截留分子量為10000。透析袋的截留分子量為10000。處理方法為在2%的NaHCO3，10-2M的Na2EDTA溶液中煮沸10min，清洗，再用去離子水煮沸[16]。

2、試劑

7.6×10-3M的維生素B6（99%，瑞士Acros Organics公司）儲備液， 0.02M的鋁儲備液由高純鋁粉溶于適量濃鹽酸，稀釋成100ml，使用時再稀釋。緩沖溶液：pH3.6~5.4由NaAc和HAc按適當比例配制，pH7.8~9.2由NH4Cl和NH3·H2O按適當比例配制。支持電解質為0.15MNaCl。實際樣品包括血清（南京紅十字血液中心提供）和腦脊液（中大醫院提供）。所用化學試劑除特別說明外均為分析純。實驗器皿使用前在1:10硝酸浸泡24h后再用自來水、蒸餾水和二次蒸餾水依次洗凈。實驗用水為二次蒸餾水。

3、實驗步驟

用細砂紙濕磨拋光玻碳電極，再用濕吸水紙輕擦，然后分別在0.1 M鹽酸溶液和蒸餾水中超聲洗滌5min。在-0.30到1.00V以100mV/s的速度掃循環伏安圖，直到電流處于穩定狀態。實驗時，將50 ml試液置于三電極系統，記錄試劑示差脈沖氧化峰電流，以100 mV/s線性掃描反掃清洗電極。每注射一次鋁溶液電磁攪拌5min，靜置1 min后記錄示差脈沖氧化峰電流。在N2氣氛保護下實驗。

平衡透析是裝有5ml血清的透析袋懸浮在裝有495ml二次蒸餾水的燒杯中24h，并且溶液被攪拌以加快平衡時間，然后用ICP-AES檢測鋁濃度。

三、結果與討論

1、測定溶液中鋁濃度方法的建立

（1）VB6的DPV圖

圖2為VB6分別在酸性和堿性兩個pH條件下無鋁和有鋁時的DPV響應圖。在研究電位區間，底液的電化學響應是較平坦的曲線。加入VB6試劑后，出現一DPV氧化峰，堿性時的峰電位均比酸性時的峰電位負。加入鋁后，峰電位不變，峰電流下降，且峰電流隨加入鋁濃度的增加呈線性下降。這是本方法的實驗基礎。

（2）測定條件的優化

鋁形態的分布及鋁-VB6配合物的形成與pH值的變化都有很大的關系。因此，pH值是測定鋁的一個非常重要的因素。pH值的影響見圖3（a,b）。從圖中可以看出，ΔIp在酸性和堿性區間的現象相同，先是隨pH增大而增加，然后分別在pH4.6、8.5處達到最大值，而后隨pH繼續增大而減小。VB6的濃度往往與測定的線性范圍及檢測限有很大關系。緩沖液的濃度也會影響測定的靈敏度。圖3(c,d)，(e,f)分別顯示了這兩種因素的影響。實驗條件優化的結果在表1中列出。

2、線性范圍、檢測下限和相對標準偏差

在上述最佳測定條件下，對線性范圍、檢測限和相對標準偏差分別進行了測定（見表2）。

3、體液中鋁形態分析

（1）SPE模擬計算的結果

采用SPE程序[17]對血清模型計算鋁形態分布，我們只考慮小分子量配體，忽略大分子量配體。由前人的工作得知，檸檬酸、磷酸是鋁的最主要的小分子量配體，故血液模型中只加入了這兩種物質。平衡常數來自文獻[17]，見表3。選取VB6加入到模擬血液的體系中來進行計算。忽略了可能存在的混配情況，以及離子強度對形態分布的影響，結果見圖4。其中縱坐標代表物種濃度占總鋁濃度的百分數。從中我們可以看出，pH=4.0~5.0時，Al3+-檸檬酸根配合物占總鋁濃度的大部分。PH=8.5時，VB6從檸檬酸配合物和四羥基鋁離子中幾乎奪取了全部的鋁離子，形成1:3的配合物。這就從熱力學上證明了VB6可用來進行對血液中鋁形態區分。

（2）實際體液中的鋁形態測定

血清的成分種類很復雜，在測定鋁之前，我們先選擇了一系列相關的生物小分子和離子做干擾實驗。酸性條件下，主要干擾為Fe3+、Fe2+、Mn2+、Cu2+（1~5倍）。然而體液中大部分陽離子自由態濃度遠低于鋁濃度，Fe、Mn、Cu主要處于配位狀態，這將減輕它們的干擾。例如，在生理pH自由態的鐵濃度比鋁的自由態濃度低七個數量級[11]，大量的鐵被鐵蛋白和鐵轉移蛋白結合[2]。其它無機離子的干擾情況為：Pb2+(10~20倍)，Ca2+和Mg2+（100~200倍），Ni2+、Li+和PO43-（200~500倍），F-(1000倍)，這些離子在體液中的濃度遠低于干擾臨界值，對本文鋁形態分析無干擾。大量的Na+、K+、NH4+、 NO3-、Cl-不干擾。有機物質的干擾情況為：EDTA、脲酸、磺基水楊酸、半胱氨酸（5~10倍），精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸（50~100倍），抗壞血酸、檸檬酸、脲素、琥珀酸、谷氨酸（200~500倍），草酸、葡萄糖、酒石酸、乳酸(>1000倍)。堿性條件下，陽離子的干擾變化不大，有機物質的干擾則明顯減輕。EDTA、脲酸、磺基水楊酸、半胱氨酸（20~50倍），精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、亮氨酸（200~500倍），抗壞血酸、檸檬酸、脲素、琥珀酸、谷氨酸(>1000倍)。

為什么不同pH條件下，各種配體的干擾倍數會又如此大的差異？問題的答案在于鋁－VB6配合物同鋁檸檬酸根配合物的穩定常數對pH的不同依賴關系造成的。在酸性條件下，有機配體表現出比VB6更強的配位結合能力。因此VB6只能奪取自由鋁，羥基鋁、硫酸根、硅酸根以及氟離子的配合物以及一小部分不穩定有機配合物中的鋁離子。但是，在堿性條件下，VB6具有比檸檬酸等配體更強的配位能力。因此，VB6不僅能奪取無機單核鋁，而且也可以從有機結合態鋁中把鋁奪取出來，在這樣的條件下，測定的鋁形態是總單核鋁組分。這也從另一方面驗證了我們的兩個pH條件下鋁形態區分思想。

用VB6分別在酸性和堿性條件下，對五個健康人的血清進行了鋁的測定，并同超濾、滲析方法進行了比較，結果見表4。

血清是一個復雜的混合物，包括脂類、蛋白質、小分子和一些無機離子等，但其中鋁的真正有效配體并不多。大分子量的主要是鐵轉移蛋白，并且可能是唯一結合鋁的蛋白質。它結合了血清中絕大部分的鋁，大約占總鋁的80%~90%[13，14]。在小分子量的配體中，檸檬酸和磷酸占據了主要地位，兩者結合了大約總鋁的10%~20%。VB6法在堿性條件下測的是總單核鋁，酸性條件下測的是無機單核鋁。也就是說，堿性條件下測定的鋁對應的是小分子量配體結合的鋁。從表4中可以看出，測定的總單核鋁占總鋁的大約15%左右，與前人工作的結果基本吻合[2,18]。

同時，這部分結果還與超濾、滲析的結果進行了比較。在血清鋁形態的分析方法中，超濾、滲析也占據了一定地位。超濾、滲析是運用物理的手段，利用配體之間的分子量差別對鋁形態進行粗分，形成了high molecular weight(HMW)和low molecular weight(LMW)兩部分。由于血清中大分子配體與小分子配體之間的分子量差別較大，故文獻報道的結果也比較一致，LMW占據了總鋁的10%~20%[2]，與用其他方法得到的結果吻合。從表4中可以看出，我們做的超濾與滲析的結果比較接近，均占總鋁的15%~20%，與文獻報道值一致[2,9]。六種試劑測定的總單核鋁與之比較，結果吻合。這也說明了VB6可以用電化學的方法對血清中的鋁形態進行粗分。

對于小分子量的配體，是檸檬酸占據主要地位，還是磷酸結合了大部分的鋁，存在兩種觀點。Ohman[20]等人認為檸檬酸是唯一的小分子量配體。Kiss[17]的工作則表明兩者在小分子量配體的部分中都有貢獻。我們測定的無機單核鋁變化較大，占總鋁的5%~15%。這個結果符合Polak[19]的觀點，他認為這部分的鋁形態隨著不同的個體變化較大。我們還對腦脊液中的鋁進行了測定，結果見表4。由于鐵轉移蛋白在腦脊液中的濃度非常的低[8]，因此Al-鐵轉移蛋白配合物在腦脊液中不存在，這一點與血清中的情況不同。堿性條件下我們得到的結果與ICP-AES的結果基本一致。這說明腦脊液中沒有含有什么強的配體。

四、結論

鋁的化學形態與它的生物效應密切相關。在本文中，我們建立了一種新型的利用VB6作為電化學配體間接對鋁進行形態區分的方法，并且將之成功的應用于體液中Al形態，區分原理是基于VB6和有機配體在不同的pH條件下對鋁離子不同的配位競爭能力。在堿性的條件下，從熱力學和動力學的角度有利于Al-VB6配合物的形成，可以測定總單核鋁。而在酸性的條件下，有機配體，如檸檬酸根，體現出對鋁離子更強的配位能力，結果測定的是無機單核鋁部分。該法開拓了一種新的對體液中鋁形態區分的思想。本法采用VB6作為測定配體，VB6作為營養藥，具有很好的生物相容性。本法進一步的改進成熟，對其機理進一步的量化考察，可以更好的發展成為一種靈敏的形態區分手段，并且結合微電極技術，也許能夠實現對活體進行鋁形態分析測定。